吴耀南名中医工作室
张冬英 吴耀南 张玉凤
摘要 目的：观察p53、CerbB-2的表达在慢性萎缩性胃炎伴异型增生的中医各证型中的变化，探讨各证型之间在病理组织学及分子生物学水平上有无差异，探索中医辨证分型的客观指标。方法：选取146例慢性萎缩性胃炎伴异型增生患者进行中医辨证分型；采用Feulgen染色和免疫组织化学S-P法检测患者胃黏膜组织中p53、CerbB-2的表达情况。结果：1.慢性萎缩性胃炎伴轻度异型增生即有癌基因的阳性表达，且轻、中、重度异型增生之间的p53阳性表达无显著性差异（P>0.05），CerbB-2在轻、重度之间存在非常显著性差异（P<0.01）。2. p53、CerbB-2阳性表达率在慢性萎缩性胃炎伴异型增生的中医各证型间呈显著性差异（P<0.05），且阳性表达率均存在胃络瘀血型>胃阴不足型>脾胃虚弱型>脾胃湿热型>肝胃不和型的递进关系。结论：1. 慢性萎缩性胃炎伴异型增生的中医辨证分型有其一定的病理组织学及分子生物学基础。2. 轻、中、重度异型增生均有癌变的可能，且随着异型增生程度的加重癌变的可能性逐渐增大。3.慢性萎缩性胃炎伴异型增生的中医证型在病情严重程度上存在一定的轻重递进关系，具体表现为胃络瘀血型﹥胃阴不足型﹥脾胃虚弱型﹥脾胃湿热型﹥肝胃不和型。4.检测p53、CerbB-2的表达可作为慢性萎缩性胃炎伴异型增生的诊断、分级和中医辨证分型的参考指标，并能协助指导临床诊治。
关键词：慢性萎缩性胃炎；异型增生；中医证型；癌基因
胃黏膜癌变是一个复杂漫长的过程，常经历数年的癌前病变阶段。胃黏膜癌前病变（Precancerous Lesions of gastric cancer，PLGC）是指慢性萎缩性胃炎（CAG）伴大肠不完全型肠化（ⅡB型）和/或中、重度不典型增生（DYS）[1]。本研究主要探讨胃黏膜癌前病变中慢性萎缩性胃炎伴异型增生者。尽管目前普遍认为慢性萎缩性胃炎伴中、重度异型增生属胃黏膜癌前病变，但临床发现轻度异型增生亦常有癌基因的阳性表达，所以本研究将轻度异型增生同样纳入研究范围。近年来研究表明，胃癌的发生、发展与癌基因激活、抑癌基因失活、抗凋亡基因过度表达、抑制细胞凋亡、刺激细胞分化和增殖密切有关[2]。特别是p53、CerbB-2的异常表达与胃黏膜癌前期病变的关系引起了高度重视，其中包括他们在慢性萎缩性胃炎伴异型增生中的表达。本研究旨在对p53、CerbB-2在慢性萎缩性胃炎伴异型增生中医各证型中的表达进行分析比较，探讨各证型在病理组织学及分子生物学水平上有无显著性差异，探索中医辨证分型的客观指标，以期更好地协助指导中医药防治胃黏膜癌前病变，阻断病情的进展和恶化。
1.材料与方法
1.1材料
所有入选病例均来自于厦门市中医院2010年1月-2014年1月门诊及住院病人，经电子胃镜检查及胃黏膜病理组织活检证实为慢性萎缩性胃炎伴异型增生，并经我院富有经验的消化内科专家根据2002年中国医药科技出版社出版的《中药新药临床研究指导原则》第一版中的中医证候诊断标准进行辨证分型。观察对象共146人，其中男78人，女68人，年龄自24-85岁，平均54.86±14.02岁。病程2～40年，平均8.58±4.27年。中医辨证为肝胃不和型22例，脾胃虚弱型26例，脾胃湿热型32例，胃阴不足型39例，胃络瘀血型27例；属轻度萎缩性胃炎者55例，中度48例，重度43例；异型增生属轻度95例，中度30例，重度21例。上述各证型间性别、年龄经齐同性检验无显著性差异（P>0.05）。
1.2方法
对此146例患者进行常规胃镜检查，并按常规取胃窦、胃体部或病灶处胃黏膜组织进行病理组织活检，新鲜标本用10%中性福尔马林溶液固定，石蜡包埋，4μｍ厚度切片，HE染色。病理检查依照上述标准证实为慢性萎缩性胃炎伴异型增生者，进一步行免疫组化检查，测定p53、CerbB-2的表达水平。
p53表达的检测
采用S-P免疫组化标记。染色前切片于0.05mol/L柠檬酸液中进行高压抗原修复，DAB显色，苏木紫对比复染。以PBS替代一抗做阴性对照。试剂盒：购自福州迈新公司。以所观察目标细胞核内出现棕黄色颗粒，且着色强度明显高于背景的非特异性着色为阳性。对p53着色强度做以下规定：未见阳性细胞者为（－）；染色淡或阳性细胞小于25％为（+）；染色适中或阳性细胞占25％～50％者为（++）；染色深或阳性细胞大于50％者为（+++）。
1.2.2 CerbB-2表达的测定
采用S-P法，抗CerbB-2抗体为鼠抗人单克隆抗体，试剂盒购于福州迈新公司，DAB显色，苏木素衬染，用PBS液代替第一抗体作阴性对照，用已知的阳性标本切片作阳性对照，并将染色强度分为：阴性（－）：无棕色反应；弱阳性(+)：部分细胞显示棕色；强阳性(++)：绝大部分细胞显示棕色。
1.3 统计方法学处理
应用SPSS17.0统计软件包进行数据处理，计数资料采用c2检验及四格表c2检验进行两样本率的比较；计量资料采用F检验，两两之间比较采用q检验。
2.结果：
2.1 p53、CerbB-2在各级异型增生中的阳性表达
表1.各级异型增生中p53、CerbB-2的阳性表达率 n(%)（n为例数）
|
异型增生 |
n（例数） |
p53 |
CerbB-2 |
|
轻度 |
95 |
38(40.0) |
20（21.1） |
|
中度 |
30 |
18(60.0) |
11 (36.7) |
|
重度 |
21 |
13(61.9) |
13（61.9） |
注：经检验p53在轻、中、重度异型增生之间的阳性表达无显著性差异(P均>0.05)，CerbB-2在轻、中、重度异型增生各组之间的阳性表达除轻、重度之间呈非常显著性差异 (P<0.01) 外，其余各组之间均无显著性差异(P均>0.05)。
2.2 证型类别与异型增生的关系
表2.证型类别与异型增生的关系 n(％)
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证型类别 |
N例数 |
异型增生 |
||
|
|
|
轻度 |
中度 |
重度 |
|
肝胃不和 |
22 |
21（95.5） |
1（4.5） |
0（0） |
|
脾胃湿热 |
32 |
26（81.2） |
3（9.4） |
3（9.4） |
|
脾胃虚弱 |
26 |
18（69.2） |
5（19.2） |
3（11.6） |
|
胃阴不足 |
39 |
21（53.8） |
10（25.6） |
8（20.6） |
|
胃络淤血 |
27 |
9（33.3） |
11（40.7） |
7（26.0） |
注：经c2检验，c2=24.645，df=8，P=0.002<0.01，各证型在轻、中、重度异型增生分布上具有非常显著性差异，且肝胃不和、脾胃湿热、脾胃虚弱、胃阴不足、胃络瘀血的轻度异型增生百分率逐渐下降，而中、重度异型增生的百分率依次上升。
2.3
表3 p53、CerbB-2在慢性萎缩性胃炎伴异型增生中医各证型中的阳性表达情况n(%)
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证型类别 |
N例数 |
p53 |
CerbB-2 |
|
肝胃不和 |
22 |
3（13.6） |
1(4.5) |
|
脾胃湿热 |
32 |
10（31.3） |
7(21.9) |
|
脾胃虚弱 |
26 |
14（53.8） |
6(23.1) |
|
胃阴不足 |
39 |
23（59.0） |
14(35.9) |
|
胃络淤血 |
27 |
19（70.4） |
16(59.3) |
注：①五组证型间p53的阳性表达应用c2检验，得出P=0.003<0.01，表明这五种证型在p53的表达上具有非常显著性差异。各证型之间进一步以四格表公式或其校正公式进行c2检验，结果显示p53在肝胃不和与脾胃虚弱、胃阴不足、胃络瘀血之间，脾胃湿热与胃络瘀血之间的阳性表达均存在非常显著性差异(P均<0.01)；脾胃湿热与胃阴不足之间差异显著P<0.05，其余两两之间比较差异性均不显著（P均>0.05），而且p53的阳性表达率胃络瘀血型>胃阴不足型>脾胃虚弱型>脾胃湿热型>肝胃不和型。
②五组证型间CerbB-2的阳性表达应用c2检验，得出P=0.014<0.05，表明这五种证型在CerbB-2的表达上具有非常显著性差异。各证型之间进一步以四格表公式或其校正公式进行c2检验，可得出CerbB-2在肝胃不和与胃阴不足、胃络瘀血之间，脾胃湿热与胃络瘀血之间的阳性表达均呈非常显著性差异(P均<0.01)，脾胃虚弱与胃络瘀血之间呈显著性差异(P<0.05)，其余两两之间均无显著性差异(P均>0.05)。而且CerbB-2的阳性表达率胃络瘀血型>胃阴不足型>脾胃虚弱型>脾胃湿热型>肝胃不和型。
3.讨论
胃黏膜上皮异型增生系指胃黏膜腺管及上皮的生长偏离了正常的组织结构和细胞分化。根据分化程度和范围将异型增生分为Ⅰ-Ⅲ或轻、中、重度三级，其中重度异型增生被国际病理学专家认为是一种明确的上皮性肿瘤性增生，代表肿瘤生长的起始阶段[3]。
胃癌的发生、发展中，既有抑癌基因的突变，又有原癌基因的激活。研究表明p53基因是胃癌中最常突变的抑癌基因，野生型p53作为一种抑癌基因，通过调控细胞生长和促进凋亡而发挥作用，突变后的p53基因不仅失去了上述作用，反具有促进细胞恶化的功能，野生型p53基因产物半衰期短，用免疫组化方法难以检测，而突变型p53基因产物的稳定性高，用免疫组化方法检测出的p53蛋白，皆为突变型基因产物，因此，可作为一种辅助诊断胃癌的标志物[4]。张凤艳等[5]研究发现胃癌组织 p53 蛋白阳性表达率明显高于胃黏膜正常组织，且随着胃癌的进展其表达逐渐升高，提示p53蛋白的异常表达与胃癌发生密切相关。并且发现 p53 表达水平与患者的年龄、性别、胃癌的类型和患者的生存率相关。
CerbB-2基因是1985年被Semba等发现的一种原癌基因，它位于17q21上，其基因表达产物是一种具有酪氨酸酶活性的糖蛋白，由大约1255个氨基酸构成，相对分子量为1.85×105，故称P185。多数研究认为CerbB-2基因的异常改变是胃癌进展的晚期事件，但也有学者发现P185蛋白在不典型增生黏膜中也有表达，主要定位于胞浆，分布具一定极性，一般在腔缘侧胞浆中，而癌细胞的P185蛋白表达主要出现在胞膜，且分布无极性。原癌基因CerbB-2被激活后，表现为基因的扩增和产物的高表达，具有致癌变活性，因而CerbB-2基因异常表达不仅与胃癌预后有关，而且与胃黏膜癌变过程相关，可作为异型增生进展的监测指标[4]。贾振军等[6]研究结果显示CerbB-2 在正常胃黏膜、胃炎组织中无表达，在胃黏膜癌前病变组织中过度表达，认为可以作为判断胃黏膜癌变的重要指标。
据本研究的表1可见，轻度异型增生即有癌基因的阳性表达，其p53、CerbB-2的阳性表达率分别为40.2％、21.6％，且随着异型增生程度的加重p53、CerbB-2的阳性表达率逐渐上升，其中p53的阳性表达率在各级异型增生之间非常接近，无显著性差异，说明在轻度异型增生中抑癌基因的突变就已非常活跃，且与中、重异型增生有一定的重叠性。表明轻度异型增生与中、重度异型增生同样存在癌变的可能。而CerbB-2阳性表达率随着异型增生程度的加重逐渐上升，其中轻、重度之间有非常显著性差异（P<0.01），说明在胃黏膜癌变过程中CerbB-2的作用与突变量和表达量的积累密切相关，是一个由量变到质变的渐进过程。因此不同程度的异型增生均有一定的癌变能力，其中以重度异型增生的癌变率为最高，与上述诸观点基本一致。所以对不同程度的异型增生的治疗均要积极，但同时要区别对待。
祖国医学中并没有“慢性萎缩性胃炎伴异型增生”这一病名，但根据其临床症状特征，可将其归于中医“胃痛”、“痞证”、“嘈杂”、“反胃”等范畴。对于其病机目前国内已较一致地认为是以脾胃气阴两虚为本，兼有气滞、或胃热、或血瘀的本虚标实之证；因虚挟邪，因实致虚是其主要的病机转化规律[7]。在古代医籍中已有详尽论述。叶天士云“胃痛久而屡发，必有凝痰聚瘀”。《证治汇补》曰：“饮食不下，心胃作痛，此痰凝血瘀”。《古今医统》亦指出：“凡食少有碍，觉屈曲而下，微作痛，此必有死血而痰然”。归纳起来病机不外乎“滞”、“热”、“虚”、“瘀”几点，故认为本病属本虚标实，本虚以脾胃气阴两虚为主，标实则有气滞、血瘀、湿阻、热毒蕴胃等，且多呈兼挟之势。本研究在所观察的病例中发现轻度异型增生以肝胃不和型、脾胃湿热型为多见，中度异型增生以脾胃虚弱型和胃阴不足型多见，至重度异型增生则以胃络瘀血型多见（见表2）。可见胃络瘀血是癌前病变的晚阶段事情，整个过程与“因邪致虚，因虚生邪”及“久病入络”、“久病必瘀”的观点是相一致的。
通过检索可知中医对本病的认识主要集中于对病因病机方面的阐述和以中医药治疗此病的经验，而就中医证型与癌基因表达之间的关系探讨不多。涂福音等[8]对1049例慢性胃炎患者进行中医辨证分型及病理组织活检，发现病理诊断为浅表性胃炎者，中医辨证分型多为肝胃不和或脾胃湿热；病理诊断为萎缩性胃炎者，中医辨证分型多为胃阴不足或脾胃虚弱。由此可知，中医证型与病理组织学之间存在一定的相关性。本研究结果显示：慢性萎缩性胃炎伴异型增生中医各证型间p53、CerbB-2阳性表达率均为胃络瘀血>胃阴不足>脾胃虚弱>脾胃湿热>肝胃不和，经检验各证型间均存在显著性差异（P均<0.05）（见表3）。以上这些结果从病理组织学及分子生物学角度证实了本病从中医证型的肝胃不和型→脾胃湿热型→脾胃虚弱型→胃阴不足型→胃络瘀血型是一个病情由轻到重的渐进过程。此与祖国医学的观点是相一致的，祖国医学认为本病发病初期以实证为主，故临床以肝胃不和型、脾胃湿热型多见；病久则“因邪致虚”，出现气虚、阴虚等证候，以脾胃虚弱型、胃阴不足型多见；后期则“因虚生邪”，虚实夹杂，以胃络瘀血型多见。
因此慢性萎缩性胃炎伴异型增生中医辨证分型确实有其一定的病理组织学及分子生物学基础，通过对本病的中医证型与癌基因表达相关性的研究，不仅为揭示本病的中医证型的客观化提供了帮助，也为深入研究其病理实质、及对临床上的合理组方、提高临床疗效提供了必要的前提条件，对于指导中医药诊治胃黏膜癌前期病变具有一定的意义。
（实用中西医结合临床,2015,15(07):4-6+12.）
